Análise do proteoma e peptidoma salivar na diabetes Mellitus tipo 1

Doutoramento em BioquímicaA Diabetes Mellitus (DM) compreende um conjunto de desordens metabólicas comuns caracterizadas por hiperglicemia, que afeta diferentes órgãos do organismo. Ao longo do tempo, ocorrem danos microvasculares no glomérulo renal, retina e nervos periféricos, bem como doença macrovascular nas artérias. A composição da saliva também é afetada pela DM, com consequências na homeostasia oral. No entanto, o proteoma e o peptidoma salivar têm sido pouco explorados na DM tipo 1 e nas suas complicações crónicas. Tendo em conta o crescente interesse na saliva como fluido diagnóstico, o objetivo principal deste trabalho foi avaliar os eventos proteolíticos subjacentes à DM tipo 1 e às suas complicações microvasculares, bem como, caracterizar as alterações induzidas pela DM tipo 1 no proteoma e peptidoma salivar. A DM tipo 1 e particularmente as complicações microvasculares associadas modulam o perfil proteolítico dos fluidos biológicos, com diferenças significativas de atividade observadas na urina e saliva, atribuídas principalmente ao complexo Metaloproteinase da Matriz (MMP)-9/lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos, aminopeptidase N, azurocidina e calicreína 1. O aumento da atividade proteolítica observado na saliva total dos diabéticos resultou no aumento da percentagem de péptidos, principalmente de um número acrescido de fragmentos de colagénio do tipo I, refletindo possivelmente um estado inflamatório crónico dos tecidos orais e periodontais. O peptidoma também corrobora uma maior suscetibilidade das proteínas salivares, especificamente, das proteínas ricas em prolina básicas (bPRP) 1, bPRP2 e proteínas ricas em prolina ácidas (aPRP) à proteólise, evidenciando a geração de fragmentos de proteínas associadas à ligação a bactérias. A análise do proteoma salivar baseada em iTRAQ mostrou uma sobre-expressão de L-plastina, fator do adenocarcinoma do pâncreas e das proteínas S100-A8 e S100-A9, enfatizando a importância do sistema imune inato na patogénese da DM tipo 1 e das complicações microvasculares associadas. A análise integrada de todas as proteínas expressas diferencialmente entre os pacientes diabéticos com ou sem complicações microvasculares e indivíduos saudáveis foi realizada com o STRING, onde se observam três conjuntos funcionalmente ligados, um compreende a interação entre o colagénio tipo I, colagénio tipo II e MMP-9, um segundo conjunto envolve a MMP-2 e o colagénio de tipo I e um terceiro conjunto composto por proteínas salivares e inflamatórias. Estes conjuntos estão associados com as vias Kegg de interação recetor-matriz extracelular, de adesão focal e migração transendotelial dos leucócitos. Por outro lado, a análise do proteoma e peptidoma salivar destacou potenciais biomarcadores para o diagnóstico e prognóstico da DM tipo 1 e das suas complicações.Diabetes Mellitus (DM) comprises a set of common metabolic disorders that share the phenotype of hyperglycemia, which affect many different organ systems in the body. Over time, DM-specific microvascular disease in renal glomerulus, retina and peripheral nerves occurs, as well as macrovascular pathology in arteries. The composition of saliva is also affected by DM with consequences in the oral homeostasis; however, the salivary proteome and even more the peptidome has been quite unexplored in type 1 DM and related chronic complications. Taking into account the growing interest in saliva as diagnosis fluid, the main goal of this thesis was to disclose the proteolytic events underlying type 1 DM and related microvascular complications as well as to characterize DM-induced alterations in salivary proteome and peptidome. Type 1 DM and particularly the associated microvascular complications modulates biofluids’ proteolytic profile, with significant activity differences noticed for urine and saliva mainly attributed to Matrix Metalloproteinase (MMP)-9/neutrophil gelatinase-associated lipocalin complex, aminopeptidase N, azurocidin and kallikrein 1. The higher proteolytic activity noticed in whole saliva of diabetics leads to an increase in the percentage of peptides, mainly consisting of an augmented number of collagen type I fragments, possibly reflecting a chronic inflammatory state of oral and periodontal tissues. Moreover, peptidome data also support a diabetes-related higher susceptibility of salivary proteins, namely basic proline-rich protein (bPRP) 1, bPRP2 and acidic proline-rich proteins (aPRP) to proteolysis evidencing the generation of protein fragments associated with bacterial attachment. iTRAQ-based salivary proteome profiling evidenced an overexpression of L-plastin, pancreatic adenocarcinoma factor, protein S100-A8 and S100-A9, emphasizing the importance of the innate immune system in the pathogenesis of type 1 diabetes mellitus and related microvascular complications. The integrative analysis of all different expressed proteins performed with STRING shows three clusters functionally connected, one comprehending collagen types I and II interaction and MMP-9, a second involving MMP-2 and collagen type I, and a third cluster compreending salivary proteins and inflammatory proteins. These clusters are associated with the Kegg pathways extracellular matrix-receptor interaction, focal adhesion, and leukocyte transendothelial migration. In addition, the salivary proteome and peptidome analysis highlighted potential biomarkers for the diagnosis and prognosis of type 1 diabetes mellitus and related complications

Proteómica das glândulas salivares de ratinho

Mestrado em Métodos Biomoleculares AvançadosA saliva é uma mistura complexa de proteínas, glicoproteínas, enzimas, hormonas, minerais e desempenha funções fisiológicas importantes. A maior produção de proteínas da saliva ocorre nas glândulas salivares, parótida, submandibular e sublingual e outras pequenas glândulas da mucosa oral. Apesar das glândulas salivares apresentarem fulcral importância para compreensão de determinadas patologias orais, o conhecimento da sua expressão proteica é ainda reduzido. Assim, o objectivo principal deste trabalho caracterização do proteoma das glândulas salivares, usando o ratinho como modelo animal. A caracterização do proteoma glandular envolveu o fraccionamento subcelular das glândulas parótida e submandibular, obtendo-se para cada uma delas, as fracções nuclear, citoplasmática e a correspondente aos grânulos secretores. Complementarmente foram isoladas células acinares das glândulas, procedendo-se ao seu fracionamento com obtenção da fracção citoplasmática. análise das diferentes fracções efectuou-se utilizando electroforese bidimensional e cromatografia líquida de alta resolução para a separação proteínas e péptidos e a digestão tríptica para posterior identificação por espectrometria de massa. Após a análise comparativa dos mapas 2DE das glândulas parótida submandibular observaram-se perfis característicos distintos. Dos mapas 2DE obtidos para as diferentes fracções de parótida e submandibular foram identificadas, respectivamente, um total de 125 e 100 proteínas, sendo 33 das quais comuns. Da análise dos digestos trípticos dos grânulos indentificaram- parótida 52 péptidos pertencentes a 17 proteínas e na submandibular 255 péptidos pertencentes a 19 proteínas. As diferentes proteínas identificadas pertenciam as diversas classes funcionais, destacando-se a classe proteolítica. Ambas as glândulas apresentaram uma grande variedade de calicreínas, principalmente a glândula submandibular onde se identificaram 15 membros desta família. Este trabalho apresenta uma abordagem generalista da composição proteica das diferentes fracções das glândulas salivares de ratinho, facilitando desenvolvimento futuro de investigações mais específicas e/ou relacionadas com uma patologia específica. ABSTRACT: Saliva is a complex mixture of proteins, glycoproteins, enzymes and hormones that play important physiological functions. The main protein sources of saliva are the salivary glands; parotid, submandibular, sublingual and numerous small glands distributed on the oral mucosa. The knowledge of salivary glands protein expression is scarce and important for the understanding of some oral pathologies. The aim of this work is the characterization of the mouse salivary glands proteome, using the mouse as the animal model. For the glandular proteome characterisation subcelular fractionation of the parotid and submandibular glands was performed, getting for each gland the nuclear, cytoplasmic and secretory granules fractions. Complementarily, glandular acinar cells were isolated and fractionated and the cytoplasmic fraction characterised. The analysis of the different fractions were performed by the separation of proteins and peptides by two-dimension gel electrophoresis (2DE) and high resolution liquid chromatography (HPLC-MS) and tryptic digestion used to further mass spectrometry identification. After the comparative analysis of mouse parotid and submandibular 2DE maps, we observed distinct profiles. From the 2DE maps obtained to the different fractions of parotid and submandibular were respectively identified a total of 125 and 100 proteins, being 33 of them commons. From the HPLC-MS data were identified 52 peptides belonging to 17 proteins in parotid and 255 peptides that belong to 19 proteins in submandibular gland. The different proteins identified belong to several functional classes, namely the proteolytic ones. In the submandibular gland about 32% of the identified proteins were from kallikreins family. The salivary glands express a great variety of kallikreins, mainly the submandibular gland in which was identified 15 proteins of this family. This work is a general approach to the protein composition of the different mouse salivary glands fractions, contributing to future research with clinical applications